3月16日，國(guó)際學(xué)術(shù)期刊Nature Metabolism在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心周斌研究組的研究成果。該研究開(kāi)發(fā)了能夠同時(shí)示蹤胰島beta細(xì)胞和非beta細(xì)胞的雙同源重組介導(dǎo)的譜系示蹤新技術(shù)。利用該技術(shù)研究人員揭示了成體胰島beta細(xì)胞的來(lái)源，發(fā)現(xiàn)在正常穩(wěn)態(tài)及組織損傷情況下成體胰島beta細(xì)胞來(lái)源于自我增殖，而非干細(xì)胞分化。該研究為糖尿病臨床治療研究提供了理論基礎(chǔ)和研究新思路。

胰島beta細(xì)胞可以分泌胰島素，具有降低血糖的功能，胰島素和胰島alpha細(xì)胞分泌的胰高血糖素協(xié)同作用維持體內(nèi)血糖穩(wěn)態(tài)。糖尿病是一種以高血糖為主要病征的代謝性疾病，具有很多并發(fā)癥，包括心臟病發(fā)作、中風(fēng)、腎衰竭、失明和截肢等，已成為嚴(yán)重威脅人類健康的一大殺手，造成了巨大的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。糖尿病主要包括I型和II型兩種，I型主要由于患者本身的免疫系統(tǒng)缺陷引起的beta細(xì)胞選擇性破壞，表現(xiàn)為胰島素缺乏引起的多食多飲多尿，血糖水平升高等。II型糖尿病占總糖尿病患者90%以上，與遺傳、肥胖和缺乏運(yùn)動(dòng)等諸多因素有關(guān)，多為中年以后發(fā)病，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)該類患者體內(nèi)胰島仍有產(chǎn)生胰島素的能力，但beta細(xì)胞數(shù)量顯著少于健康個(gè)體，胰島素處于一種缺乏狀態(tài)。因此，闡明胰島beta細(xì)胞在體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和不同病理狀態(tài)下來(lái)源，可以為糖尿病的臨床治療提供新的研究方向，具有重要科學(xué)意義。

成體哺乳動(dòng)物胰島中beta細(xì)胞的來(lái)源目前仍有較大爭(zhēng)議，主要報(bào)道了兩種不同的機(jī)制：胰島beta細(xì)胞的自我復(fù)制和由非beta細(xì)胞生成新的beta細(xì)胞（稱為新生）。關(guān)于第一種機(jī)制，不同研究組利用遺傳譜系示蹤技術(shù)證明了beta細(xì)胞自我復(fù)制是哺乳動(dòng)物出生后以及不同損傷條件下產(chǎn)生新beta細(xì)胞的主要手段。第二種機(jī)制則認(rèn)為beta可能是通過(guò)分化的非beta細(xì)胞轉(zhuǎn)分化或通過(guò)胰島干細(xì)胞或祖細(xì)胞的分化而產(chǎn)生的。

周斌研究組長(zhǎng)期致力于新型遺傳譜系示蹤技術(shù)的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用，在該項(xiàng)研究中，他們建立了一種可以同時(shí)標(biāo)記胰島beta細(xì)胞和非beta細(xì)胞的新型雙同源重組介導(dǎo)的譜系示蹤新系統(tǒng)。在研究組前期開(kāi)發(fā)的Dre-rox和Cre-loxP的雙同源重組酶介導(dǎo)的遺傳譜系示蹤技術(shù)（He et al., Nature Medicine 2017）基礎(chǔ)上，研究人員突破以往研究模式，不再依賴單一分子標(biāo)記追蹤某一群細(xì)胞分化情況，而是同時(shí)且不可逆地區(qū)分標(biāo)記所有beta細(xì)胞和其他可能含有潛在干細(xì)胞的所有非beta細(xì)胞。研究人員使用實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的正交位點(diǎn)特異性雙同源重組系統(tǒng)Cre-loxP和Dre-rox的交叉型報(bào)告小鼠IR1。在IR1報(bào)告小鼠中，兩對(duì)重組識(shí)別位點(diǎn)（rox和loxP）交錯(cuò)排列，這樣，一次成功的重組可以誘導(dǎo)表達(dá)一種遺傳報(bào)告基因，并且阻止了另一次重組的發(fā)生。該設(shè)計(jì)可以用兩個(gè)不同的永久遺傳標(biāo)記同時(shí)區(qū)分標(biāo)記beta細(xì)胞和非beta細(xì)胞：tdTomato和ZsGreen。

研究人員首先利用該系統(tǒng)研究了在成體胰腺生理穩(wěn)態(tài)過(guò)程中beta細(xì)胞的來(lái)源，在6周齡大的Ins2-Dre;R26-iCre;IR1小鼠上誘導(dǎo)Dox1周，然后在3或6個(gè)月后分析胰腺組織，組織熒光檢測(cè)可以看到整個(gè)胰腺組織標(biāo)記為ZsGreen，中間夾雜著tdTomato陽(yáng)性信號(hào)。通過(guò)切片染色發(fā)現(xiàn)胰島 beta細(xì)胞仍標(biāo)記為tdTomato，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)ZsGreen陽(yáng)性的beta細(xì)胞，說(shuō)明在生理穩(wěn)態(tài)條件下，beta細(xì)胞主要來(lái)自于已有beta細(xì)胞的自我復(fù)制。

研究人員還構(gòu)建了胰腺部分切除（partial pancreatectomy, PPX）和妊娠（pregnancy）介導(dǎo)的胰島beta細(xì)胞再生模型、胰腺導(dǎo)管結(jié)扎（pancreatic duct ligation, PDL）模型、鏈脲佐霉素（streptozotocin, STZ）介導(dǎo)的糖尿病模型等，在這些非遺傳操作損傷模型中均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)ZsGreen陽(yáng)性的細(xì)胞表達(dá)胰島素。此外，還構(gòu)建了新的白喉毒素介導(dǎo)的細(xì)胞清除小鼠IR1-DTR，對(duì)Ins2-Dre;R26-iCre;IR1-DTR小鼠注射白喉毒素，研究人員發(fā)現(xiàn)在清除絕大部分beta細(xì)胞（>99%）的情況下，恢復(fù)一段時(shí)間后可以找到少量ZsGreen陽(yáng)性的細(xì)胞表達(dá)胰島素，說(shuō)明即使非beta細(xì)胞貢獻(xiàn)少量胰島素陽(yáng)性細(xì)胞，該系統(tǒng)也可以捕捉到，證明了該示蹤系統(tǒng)的有效性。

Ins2-Dre作為一種持續(xù)性重組酶，可能會(huì)意外地標(biāo)記非常罕見(jiàn)的假定干細(xì)胞，這些干細(xì)胞可能瞬時(shí)表達(dá)過(guò)胰島素。為了避免這種可能存在的情況，周斌組建立了一種可誘導(dǎo)性飽和示蹤的方法（Lineage Tracing at Saturation）。研究人員構(gòu)建了新的特異性誘導(dǎo)型Ins2-DreER基因敲入小鼠品系和靶向Hipp11（H11）基因座的報(bào)告基因工具小鼠H11-rox-tdTomato。在成體階段通過(guò)他莫昔芬誘導(dǎo)beta細(xì)胞進(jìn)行遺傳標(biāo)記（ tdTomato），那么其他非beta細(xì)胞為tdTomato陰性。在一段時(shí)間之后，如果有tdTomato陰性的非beta貢獻(xiàn)產(chǎn)生新的beta細(xì)胞，它們將表達(dá)胰島素，因?yàn)榇藭r(shí)已經(jīng)沒(méi)有他莫昔芬發(fā)揮作用而不會(huì)被tdTomato標(biāo)記上。該策略的精確度很大程度上取決于beta細(xì)胞誘導(dǎo)標(biāo)記效率。如果beta細(xì)胞標(biāo)記的飽和度非常接近100％（比如99.9％），當(dāng)tdTomato陰性的beta細(xì)胞的百分比顯著增加（超過(guò)0.1％），則可以解釋為新的beta細(xì)胞產(chǎn)生于干細(xì)胞。研究人員利用這個(gè)高效且特異的可誘導(dǎo)型beta細(xì)胞示蹤系統(tǒng)研究了不同生理病理?xiàng)l件下beta細(xì)胞來(lái)源，再次證實(shí)beta細(xì)胞主要來(lái)源于已有beta細(xì)胞的自我復(fù)制。

綜上，該研究的亮點(diǎn)在于開(kāi)發(fā)了一種雙同源重組酶介導(dǎo)的譜系示蹤新技術(shù)，來(lái)研究成體胰島beta細(xì)胞來(lái)源。該研究突破了傳統(tǒng)思維模式和技術(shù)局限性，可以不依賴于beta細(xì)胞干細(xì)胞或祖細(xì)胞的特定標(biāo)記，同時(shí)且不可逆地區(qū)分標(biāo)記胰島beta細(xì)胞和非beta細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)不同生理及損傷狀態(tài)下，成體beta細(xì)胞產(chǎn)生主要來(lái)源于自我復(fù)制，而非干細(xì)胞分化。新構(gòu)建的一系列遺傳工具小鼠可以為胰島beta細(xì)胞及其他組織器官發(fā)育、疾病、再生等研究提供強(qiáng)大的技術(shù)支持，該研究成果可以為糖尿病臨床治療提供重要理論基礎(chǔ)和新的研究方向。

周斌研究組博士后趙歡為該論文第一作者，周斌為該論文通訊作者。該工作得到康奈爾大學(xué)威爾-康奈爾醫(yī)學(xué)院教授Qiao Zhou、香港中文大學(xué)教授Kathy O. Lui的大力支持。該工作也得到分子細(xì)胞卓越中心動(dòng)物平臺(tái)和細(xì)胞分析技術(shù)平臺(tái)的大力支持，并得到來(lái)自中科院、國(guó)家自然科學(xué)基金委、科技部以及上海市科委等的經(jīng)費(fèi)支持。

不同情況下成體胰島beta細(xì)胞的來(lái)源