狼山雞體細胞“克隆”后代中出現羽色表型相似的個體。揚州大學供圖
■記者 李晨 通訊員 虞璐
自1997年“多莉”克隆羊問世以來，已經有20多種哺乳動物相繼實現了體細胞克隆的無性繁殖。然而，由于特殊的卵生生殖模式，體細胞克隆方法無法在禽類動物中使用，因此禽類動物的保種、挽救、瀕危復原和生物工程育種等工作遇到了瓶頸，且一直未被突破。
近日，《自然—通訊》雜志在線發表了揚州大學動物科學與技術學院教授李碧春和陳國宏研究團隊的最新研究文章。該文章介紹了將雞體細胞（成纖維細胞）逆轉為原始生殖細胞繁殖后代的理論研究和方法體系。
破解禽類動物體細胞克隆難題
文章共同通訊作者陳國宏告訴《中國科學報》，哺乳動物體細胞克隆技術的原理是將重編程的體細胞移植到去核的卵母細胞中，形成重構胚胎，然后移植入代孕母體中繼續發育，產生出克隆動物，例如克隆羊“多莉”。
“但這一技術無法在禽類動物上實施。”文章共同通訊作者李碧春說。主要原因是，“禽類受精卵（蛋）排出時已經發育到具有大量細胞的晚期囊胚階段，且和卵黃密切相連吸取營養。”
團隊成員左其生介紹，禽蛋中除了卵母細胞（未受精卵）或早期胚胎（受精卵）外，還含有大量胚胎發育需要的營養物質（卵黃）；加之，禽類卵母細胞的核大且只被薄薄的一層細胞質包裹，這使得去除和移入細胞核這個過程很難實施。
如果沿用哺乳動物體細胞核移植方式，將重構胚胎植入雞蛋中，就相當于把已經“著床”在子宮里的胚胎去掉，再換上重構胚胎繼續發育。
“這個過程目前在卵生動物上不可能實現。”文章作者張亞妮表示，“這就使得禽類動物的克隆遇到了難以逾越的問題，這一瓶頸阻礙了禽類遺傳學、發育生物學和家禽業生物工程育種、種質資源保存與瀕危禽類恢復，以及遺傳分子機制等領域的研究工作進展。”
目前我國擁有非常豐富的畜禽品種資源。陳國宏認為，做好畜禽品種資源的保護是將來優良性狀利用和生物工程育種的基礎，挖掘和建立合適的保種體系就顯得尤為必要。
在哺乳動物中，無論是體細胞克隆技術，還是配子和胚胎凍存技術都可以有效地保護當下的品種資源。但是在禽類動物上，這些方法并不完全適用，因此需要開辟新的方法。
“我們的研究利用了雞原始生殖細胞隨血液遷移的特點，首先將供體細胞，即成纖維細胞，在體外轉分化為原始生殖細胞，再異體移植到受體中，使其借用受體性腺的環境發育成精子或卵子，待受體雞性成熟后相互交配，產生來源于供體雞的后代。由于與哺乳動物體細胞克隆有不同之處，因此我們稱其為類克隆雞。”李碧春說。
“類克隆雞的產生，不僅能為禽類動物的種質資源保護和瀕危禽類的恢復提供一種新方法，而且為未來禽類動物的生物工程育種、性狀遺傳機制解析等基礎研究工作提供新途徑。”陳國宏說。
實現體細胞高效逆轉為原始生殖細胞
該團隊2010年就啟動了類克隆雞的研究工作。隨著對雞原始生殖細胞生物特性研究的不斷深入，他們發現，雞原始生殖細胞可作為工具細胞進行類克隆雞的生產，但遇到了如何大量獲取原始生殖細胞的難題。
雖然在哺乳動物中已經建立了高效的體外誘導原始生殖細胞的方法體系，但在禽類動物上該方法體系尚未建立。
左其生介紹，該團隊前期已建立了原始生殖細胞遷移歸巢并生產后代雞的模型，為雞的種質資源保護和恢復提供了新思路。
但由于分離雞體內來源的原始生殖細胞數量少，且需以犧牲早期胚胎為代價，因此該團隊一直探尋能夠獲得大量原始生殖細胞的方法體系。
他們先建立了胚胎干細胞體外誘導分化為原始生殖細胞的體系，但胚胎干細胞也不容易獲得。“體細胞重編程技術給我們的研究提供了一種很好的思路，體細胞經過重編程能夠形成與胚胎干細胞類似的有分化潛能的誘導性多能干細胞，且體細胞的分離和冷凍技術相對容易，能夠在短時間內大量獲取，對個體也不會造成較大傷害。”左其生說。
因此，他們選擇雞成纖維細胞，先將其重編程為誘導性多能干細胞，再進一步誘導分化為原始生殖細胞，這樣就可以極大地解決原始生殖細胞無法大量獲得且分離培養困難的問題。
經過10多年的探索攻關，該團隊將我國黑羽狼山雞的體細胞逆轉成原始生殖細胞，并移植到隱性白羽白洛克受體雞（代孕雞）體內，產出了來源于供體黑羽狼山雞的后代。
體細胞復原為活禽成為現實
“該技術是一項全新的將體細胞復原為活體的方法，是一次改變禽類生物工程育種和種質資源保護傳統規則的創新，對家禽產業發展具有重要的實踐意義。”一位文章評審專家點評稱。
“這項研究可利用雞的體細胞生產后代，這一技術成為生產克隆雞的游戲規則改變者，對雞肉研究領域非常有用。”另一位評審專家評價說。
經過探索，李碧春和陳國宏研究團隊還系統解析了雞體細胞重編程和原始生殖細胞發生的調控機制，建立了高效的體細胞重編程、誘導多能性干細胞分化為原始生殖細胞以及原始生殖細胞異體移植的方法體系。
“將這三項技術結合使用，成功地實現了將體細胞復原為活禽。這項工作突破了禽類遺傳工程操作困難的瓶頸，為禽類動物的保護和瀕危品種的復原提供了理論依據和技術支持。將來結合基因編輯技術，可有效地獲得基因修飾后代，加快禽類動物的生物工程育種進程。”李碧春介紹。
目前，該團隊還建立了快速而有效的雞皮膚組織冷凍保存的技術體系，且能從解凍復蘇后的皮膚組織中獲得細胞并將其誘導成為原始生殖細胞，為禽類動物種質資源長期保存提供了技術支撐。
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