■記者 田瑞穎

糖蛋白激素是輔助生殖、治療甲狀腺等疾病的關(guān)鍵藥物。近幾十年來(lái)，雖然糖蛋白激素臨床應(yīng)用已經(jīng)取得很大成功，但它如何激活人體細(xì)胞中的受體機(jī)制，是長(zhǎng)期以來(lái)科研人員難以打開(kāi)的“黑匣子”。

在9月22日發(fā)表于《自然》的一項(xiàng)研究中，中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所（以下簡(jiǎn)稱上海藥物所）研究員徐華強(qiáng)、蔣軼、蔣華良等聯(lián)合浙江大學(xué)教授張巖團(tuán)隊(duì)、北京協(xié)和醫(yī)院院長(zhǎng)張抒揚(yáng)團(tuán)隊(duì)，打開(kāi)了這個(gè)“黑匣子”。他們首次解析了糖蛋白激素受體，即全長(zhǎng)促黃體生成素/絨毛膜促性腺激素受體（LHCGR）處于失活狀態(tài)和多種激活狀態(tài)下的4個(gè)結(jié)構(gòu)，為糖蛋白激素如何識(shí)別與激活其受體提供了詳細(xì)的分子機(jī)制，有助于臨床開(kāi)發(fā)替代激素治療的小分子藥物。

起底“激活狀態(tài)”下的受體結(jié)構(gòu)

糖蛋白激素主要分為兩類。一類是促性腺激素，包括促黃體生成素（LH）、促卵泡激素（FSH）和絨毛膜促性腺激素（CG）；另一類是促甲狀腺激素（TSH）。激活人體細(xì)胞中的受體機(jī)制始終未知，極大限制了人們對(duì)該類受體的激素選擇性。此外，結(jié)構(gòu)信息缺乏也制約了靶向該類受體的小分子治療藥物研發(fā)。

糖蛋白激素受體結(jié)構(gòu)之所以難解，與其特殊性有密切關(guān)系。糖蛋白激素受體為A類G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR），但與大多數(shù)A類GPCR不同，它包含由340~420個(gè)氨基酸構(gòu)成的巨大N端胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域（ECD）。該結(jié)構(gòu)域由富含亮氨酸的重復(fù)序列構(gòu)成，且存在復(fù)雜的糖基化修飾。

徐華強(qiáng)告訴《中國(guó)科學(xué)報(bào)》：“因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)特殊，糖蛋白激素受體很難重組表達(dá)。此外，除了傳統(tǒng)的跨膜區(qū)，它還有一個(gè)較大的胞外區(qū)，也造成其表達(dá)非常不穩(wěn)定。”

體外獲得全長(zhǎng)激素受體可謂困難重重。論文第一作者、上海藥物所博士研究生段佳告訴《中國(guó)科學(xué)報(bào)》：“擺在我們面前的第一個(gè)難題就是CG配體。一般情況下，我們都是自己表達(dá)純化配體，但‘折騰’了兩個(gè)月后，發(fā)現(xiàn)效果并不理想。”

在一次上網(wǎng)查資料時(shí)，她驚喜地發(fā)現(xiàn)醫(yī)院有現(xiàn)成的CG處方藥，“如果使用處方藥，可能效果會(huì)不錯(cuò)”。后續(xù)實(shí)驗(yàn)證明了這一猜想，他們進(jìn)而解決了CG配體的難題。

但常規(guī)方法制備出的蛋白量不僅很少，結(jié)果也不穩(wěn)定。通過(guò)查閱文獻(xiàn)，段佳發(fā)現(xiàn)，糖蛋白激素受體存在很多點(diǎn)突變，這些突變會(huì)引起一系列疾病。為此，她對(duì)文獻(xiàn)中涉及的所有突變進(jìn)行篩選，最后鎖定了能夠使受體持續(xù)性激活的突變S277I。“通過(guò)引入這一突變，不僅讓受體更加穩(wěn)定，還提高了受體的表達(dá)量。”

在單顆粒冷凍電鏡技術(shù)的“加持”下，研究團(tuán)隊(duì)最終解析了3個(gè)近原子分辨率的全長(zhǎng)LHCGR處于激活狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)，包括結(jié)合內(nèi)源性激素CG的LHCGR（野生型）受體結(jié)構(gòu)（4.3埃）、結(jié)合內(nèi)源性激素CG的LHCGR（含持續(xù)性激活突變S277I）受體結(jié)構(gòu)（3.8埃）以及結(jié)合內(nèi)源性激素CG和小分子化合物Org43553的LHCGR（含持續(xù)性激活突變S277I）受體結(jié)構(gòu)（3.2埃）。

不能缺位的“失活狀態(tài)”

解開(kāi)激活狀態(tài)下的全長(zhǎng)LHCGR結(jié)構(gòu)謎團(tuán)，只是第一步。“很多現(xiàn)象僅靠解析激活狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)是不夠的。”段佳說(shuō)，“以往解析GPCR時(shí)，都是配體與受體的跨膜區(qū)相互作用后，引起跨膜區(qū)的構(gòu)象變化，進(jìn)而激活受體。但對(duì)于糖蛋白激素受體的激活，配體僅僅與受體胞外域相互作用，在沒(méi)有接觸到受體跨膜區(qū)的情況下，仍然能夠引起跨膜區(qū)構(gòu)象的變化。”

這意味著，只有繼續(xù)解析失活狀態(tài)下的糖蛋白激素受體結(jié)構(gòu)，才能完整揭示該類受體的激活機(jī)制。雖然激活狀態(tài)下的解析工作為后續(xù)研究奠定了重要基礎(chǔ)，但仍然遇到了很多困難。

“在開(kāi)展這項(xiàng)研究之前，沒(méi)有任何單獨(dú)GPCR的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)報(bào)道。而糖蛋白激素受體非常不穩(wěn)定，可能純化過(guò)程中就降解了。”段佳說(shuō)。

團(tuán)隊(duì)又嘗試了很多辦法，但效果并不明顯。他們想，也許在純化蛋白過(guò)程中加入小分子抑制劑能使蛋白更加穩(wěn)定。通過(guò)這種方式，團(tuán)隊(duì)克服了全長(zhǎng)失活受體構(gòu)象高度不穩(wěn)定的技術(shù)難題，并通過(guò)擴(kuò)大數(shù)據(jù)量，最終解析了失活狀態(tài)下全長(zhǎng)LHCGR的電鏡結(jié)構(gòu)，分辨率為3.8埃。

通過(guò)對(duì)比激活LHCGR結(jié)構(gòu)，團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)受體的ECD發(fā)生了大約45度偏轉(zhuǎn)。進(jìn)一步通過(guò)結(jié)構(gòu)分析和功能試驗(yàn)驗(yàn)證，他們最終提出了糖蛋白激素受體激活的“推拉”模型。“這是第一個(gè)全長(zhǎng)單獨(dú)GPCR的電鏡結(jié)構(gòu)。”徐華強(qiáng)說(shuō)。

助攻小分子藥物研發(fā)

近年來(lái)，小分子藥物研發(fā)逐漸表現(xiàn)出巨大優(yōu)勢(shì)，也越來(lái)越受到患者和市場(chǎng)的青睞。徐華強(qiáng)表示：“一方面，小分子藥物可以口服，減少了患者身體痛苦和心理負(fù)擔(dān)；另一方面，小分子藥物可控性和依從性更強(qiáng)，可以做到定時(shí)定量。”

為此，研究人員還解析了處于1期臨床試驗(yàn)中的小分子化合物Org43553與LHCGR相互作用的分子細(xì)節(jié)，揭示了Org43553的結(jié)合口袋，為臨床開(kāi)發(fā)針對(duì)LHCGR、FSHR和TSHR的選擇性小分子藥物替代激素治療提供了重要的結(jié)構(gòu)模板。

實(shí)際上，國(guó)內(nèi)外對(duì)糖蛋白激素的關(guān)注由來(lái)已久。10年前，徐華強(qiáng)團(tuán)隊(duì)就開(kāi)始研究糖蛋白激素受體結(jié)構(gòu)，但受限于當(dāng)時(shí)的結(jié)構(gòu)解析技術(shù)，研究?jī)H開(kāi)展兩年便被迫擱置。

兩年前，徐華強(qiáng)團(tuán)隊(duì)聯(lián)合合作者重啟該項(xiàng)目。在他看來(lái)，研究之所以成功，除了冷凍電鏡技術(shù)的進(jìn)步，還得益于上海藥物所的技術(shù)和平臺(tái)支撐、不同方向團(tuán)隊(duì)的精誠(chéng)合作。

“糖蛋白激素受體結(jié)構(gòu)解析只是第一步，也是最關(guān)鍵的一步。雖然糖蛋白激素作用機(jī)制在整個(gè)家族是通用的，但與受體之間也存在特異性，仍然需要結(jié)構(gòu)生物學(xué)來(lái)解答。此外，我們還希望進(jìn)一步解析FSH和TSH等受體結(jié)構(gòu)，揭示不孕不育、甲亢或甲減等疾病的分子機(jī)制，為治療相關(guān)疾病藥物的研發(fā)提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。”徐華強(qiáng)表示。