抗生素能救命，但抗生素濫用帶來的超級細菌耐藥也能致命。世衛組織專家估計，到2050年，由于細菌對抗生素耐藥導致的死亡人數可能從目前估計的每年70萬人增加到每年1000萬人，世界生產總值的損失將達到100萬億美元。

科研人員在拉曼檢測板上滴加氘標記后的尿液細菌標本

近日，中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所（以下簡稱蘇州醫工所）聯合復旦大學附屬華山醫院、英國牛津大學的科研團隊，開發了一種適用于血液和尿液標本的快速藥敏檢測方法（FRAST），相關研究成果發表于《分析化學》。

論文第一作者、蘇州醫工所研究員宋一之告訴《中國科學報》：“FRAST將尿液和血液標本的藥敏檢測時間由3～4天分別縮短為3小時和21小時，有望讓抗生素精準狙擊細菌。”

不夠快、不夠準

“藥敏檢測如果能在獲得標本當天完成，是最理想的。”論文作者之一、復旦大學附屬華山醫院主任醫師徐曉剛向《中國科學報》解釋道，“只有拿到藥敏報告后，才可以實現精準用藥。”

藥敏定量試驗中的MIC（minimum inhibitory concentration）值，即在體外抑制細菌生長的最低藥物濃度，一直是微生物藥敏試驗、抗菌藥效評價和臨床抗菌方案制定的主流標準與主要依據之一。

徐曉剛介紹說，普通細菌的培養至少需要一天時間，厭氧菌可能需要72個小時，之后再做藥敏試驗還需要大概20個小時。粗略計算下來，3～4天對藥敏檢測來說是一個必要時間。

由于尿液細菌含量相對血液來說要多，節約了細菌培養的時間，使尿液藥敏檢測比血液藥敏檢測用時短，但還是無法在一個工作日內完成。現在的藥敏檢測流程不僅耗時耗力，并且對體外生長緩慢的病菌無能為力。

研究人員還發現，MIC只能從抑制細胞數目擴增這一角度反映與測量藥效，卻無法檢測處于NGMA（Non-Growing but Metabolically Active）狀態的病菌，即在藥物作用下已經不再增殖但仍然具備代謝活性的存活細胞。如果在抗菌治療中成為漏網之魚，將貽誤病情，引起復發性感染。

徐曉剛在臨床中發現，這種狀態的病菌也是十分常見的，帶來的結果就是在治療感染類疾病時，存在濫用和過度使用抗生素的情況，進而誘導耐藥菌乃至“超級細菌”的頻繁出現。

不夠快、不夠準，已經成為傳統方法制定抗菌治療方案中不可避免的現狀。快速檢測感染細菌的藥敏特性，對確保有效抗生素的使用和減少對廣譜藥物的需求起著關鍵作用。那么如何準確且快速的判斷感染細菌的藥敏特性呢？

為什么用拉曼光譜

1928年，印度科學家拉曼在實驗室發現，單色入射光透射到物質中的散射光包含與入射光頻率不同的光，即拉曼散射。拉曼也因此獲得諾貝爾獎。

近年來，英國牛津大學副教授黃巍一直利用拉曼光譜進行單細胞的研究工作，同時也開發了拉曼與穩定同位素標記聯用技術，是一位將拉曼引入單細胞分析中先行者。

細菌大多是單細胞。黃巍在采訪中提及，單細胞拉曼圖譜最大的特點就是無需外源標記，展現的是細胞的內在信號，可以視為細胞的化學指紋或者化學畫像，又稱為細胞的表型，是基因和環境互相作用的結果。

宋一之曾師從于黃巍學習拉曼光譜技術，通過學術交流活動，他們與華山醫院抗生素研究所所長王明貴和徐曉剛相識。在兩位同時具有臨床和科研經驗的醫生介紹臨床藥敏檢測的困局之后，宋一之和黃巍立刻啟動了單細胞拉曼光譜—重水標記聯用技術對耐藥菌的檢測研究。

為什么選擇該項技術？宋一之向《中國科學報》介紹道，單細胞拉曼圖譜可以看作一個細胞所有分子拉曼光譜指紋的總和，而細胞代謝的變化或者其他內在差異都會引起細胞表型的變化，并繼而反映在細胞拉曼光譜信息中。

研究發現，具有代謝活性的細菌在重水（氘代水）環境中會將氘元素整合進細胞內，這一過程稱為氘標記。氘標記后的細菌的拉曼光譜中產生新的碳—氘特征峰，成為了單細胞水平細菌代謝活動的生物標記物。

宋一之說：“在抗生素作用下，易感菌代謝活性會受到抑制，而耐藥菌則不受影響并產生明顯的碳—氘峰，這一過程不依賴于細菌的增殖，對樣品中細菌的數量要求也很低。因此通過單細胞拉曼光譜檢測細胞活性，可以克服臨床微生物試驗對長時間培養的要求，使快速藥敏成為可能。”這就是基于拉曼光譜—重水標記聯用技術的FRAST方法。

“從樣本到報告”的快速診斷

據悉，拉曼光譜—重水標記聯用技術可以直接作用于單細胞而無需培養，并在幾分鐘內鑒定病原微生物種類，通過標記后（1～2小時）的拉曼特征峰，判定感染細菌的代謝活性，快速篩選有效抗生素種類。

以尿液感染標本檢測為例，宋一之介紹了FRAST方法：“首先通過離心收集尿液中的細菌，之后在共聚焦顯微拉曼系統下，對細菌觀察并進行拉曼指紋圖譜的采集，這一過程可判斷尿液中是否有菌及菌量。”

研究人員將采集到的拉曼光譜利用機器學習模型，與已經建立的革蘭氏陰性菌和陽性菌的拉曼光譜數據庫進行比對，預測樣品中細菌的革蘭氏陰陽性，并以此選擇合適的藥敏板。在重水環境中與不同種類和不同濃度的抗生素作用1～2小時后，細菌的拉曼光譜再次被采集，并通過算法分析其碳—氘峰強度特征。

試驗過程中，研究人員對包含質控菌株和血液與尿液原始標本在內的超過3000個樣本，采集了6萬余張單細胞拉曼光譜，并與臨床金標準（微量肉湯稀釋法或臨床自動藥敏系統）進行了對比，結果顯示，FRAST方法對革蘭氏染色結果的預測準確率為100%，藥敏結果與金標準總體一致率大于88%。

“這是迄今為止拉曼—重水標記聯用技術在病原菌藥敏檢測中最完整的研究數據集，因此對于該技術的臨床應用具有重要的指導作用。”宋一之表示，基于拉曼的革蘭氏染色預測方法的整合，使得FRAST成為相對獨立完整的測試方法，臨床醫生可以無需其他手段輔助，完成“從樣本到報告”的快速診斷。

該方法的優勢在于，在顯微拉曼系統下，僅需幾十個細胞就可以獲得有代表性的結果；氘標記不依賴細菌的生長，因此可以有效縮短時間。另外，與近年來發展較快的耐藥基因的分子診斷技術相比，FRAST藥敏是基于抗生素對細菌作用的表型，因此該結果不會因未知的耐藥機制或基因表達調控影響而產生對藥敏的誤判。

宋一之告訴《中國科學報》：“目前，臨床微生物檢驗流程中使用的技術多數由國外研究團隊和公司提出并開發，FRAST等新技術的出現將有助于我國科研和醫務工作者實現彎道超車，在病原菌感染快速診斷技術與裝備方面形成原創技術與核心競爭力。”

他也指出該方法在技術層面存在的困難——快速檢測拉曼信號。“由于拉曼信號本身較弱，細菌個體比較小，如何快速、高靈敏地檢測到檢測信號是一個挑戰。”未來，宋一之等研究者希望借助拉曼信號增強技術和自動化手段，進一步縮短時間、提升靈敏度，使其能更早的用于人類與病原菌的戰爭中。（沈春蕾）